恶性淋巴瘤是淋巴细胞恶变形成的恶性肿瘤,已成为世界上流行较广的血液系统恶性肿瘤,其发病率和死亡率呈现逐年上涨的趋势,目前临床用药存在单组分、单靶点、价格昂贵的特点。与此同时,随着国家对中医药发展日趋重视,基于中药研发新的抗瘤药物成为医药发展的重要内容之一,中药被称 为“从本质出发的生活之道”,认可度逐步提高,与此同时,与“科学技术下的医学宠儿”西药相互结合,融生而来的中西药,彼此取长补短,实现从整体到局部的,多单一到多组分的新型治疗模式,为抗瘤药物的研发提供新方向。在此背景之下,河南科技大学学子基于超高效液相色谱(UPLC)技术进行实验方法学的创新和优化,对多种中药、西药以及药物相互作用下的药代动力学进行研究。
那么,何为UPLC呢?事实上,现关于药代动力学研究的普遍检测技术HPLC-UV法与LC-MS法,其中,HPLC-UV法应用最多且最广泛。UPLC的诞生,为精准分析药代动力提供了可能,UPLC借助于HPLC的理论及原理,涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术,增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。这种方法相比于现有检测方法,UPLC能够更好地解决了药代检测繁琐、困难、污染环境等特点,是一种新兴的检测方式,为药代动力学检测开创新高。此外,它不受药品种类影响,因此不仅仅局限于某一种药品或组合的检测,在研究三种或三种以上药品混合使用中发挥重要角色。
图为现有药代检测技术与UPLC-MS/MS技术的优势比较
图为HPLC(左)与UPLC(右)的流动速度比较
聚焦时代热点,关注民生健康。芍药苷已被证实其在抗免疫系统恶性肿瘤的药理效应,且存在副作用小、取材方便等特点,但其药代动力学研究领域仍存在相对空白。团队以芍药苷为研究对象,着手开始实验设计与实践。
图为团队成员在查阅资料,做好实验前准备
团队旨在建立一种可靠、简便的超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)检测比格犬血浆中芍药苷的浓度,并研究其药代动力学。以藁本内酯为内标,用Acquity UPLC BEH C18色谱柱分离芍药苷和内标。流动相为乙腈和0.1%甲酸水溶液。流速为0.3mL/min,采用ESI三相四极杆质谱对芍药苷在m/z498.2→179.0和内标在m/z191.1→91.0的跃迁进行多反应监测-阳离子模式监测。芍药苷在比格犬血浆中的线性范围为1-200ng/mL。日内、日间精密度(RSD%)<10.37%,准确度(RE%)<±2.08%。简而言之,团队建立了一种可靠、简便的超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS),用于检测比格犬血浆中芍药苷的浓度,并成功开展了芍药苷在比格犬体内的药代动力学研究。
与此同时,泽布替尼成为中国自主研发新药,其通过抑制布鲁顿酪氨酸激酶的异常表达,用于治疗淋巴瘤,然而,其相关药代研究存在空白。团队将UPLC-MS/MS的检测技术应用于以泽布替尼为代表的西药研究上,对检测方法学进行创新和改良:所使用的柱是Acquity BEH Ca 柱(2.1mm,50mm,1.7um),注射量为2pul。梯度洗脱程序为:0-1min,10-10%A;1-1.1min,10-90%A;1.1-2.1min,90-90%A;2.1-2.2min,90-10%A;2.2~3.0min,10~10%A;流动相A为0.1%甲酸,B为乙腈,总分析时间3min。质谱采用正离子模式,扫描模式为电喷雾电离为离子源的多反应监测模式。血浆样品采用蛋白沉淀法处理。标准曲线线性良好(r2=0.9998),定量限为1.0~1000ng/ml,最低定量限为1ng/ml。日内、日间精密度(RSD)<5.88%,准确性(RE)在1.56~1.08%之间。最终实验结果表明,泽布替尼在比格犬血浆中的回收率为90.12~93.53%(RSD为1.67~6.42%),ME值为 98.70~101.06%(RSD为5.37~8.49%,n=6),均符合美国食品药品监督管理局的要求。
近年来,有研究表明,白花丹素能够触发活性氧的形成和细胞凋亡,对癌细胞具有细胞毒性,起辅助作用;他泽美司他治疗复发或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤,但疗效一般,与其他药物相互作用不明确,二者联合使用将带来怎样的药理效果,引发团队成员的思考。团队建立灵敏、快速的超高效液相色谱-质谱联用(UPLCMS/MS)测定大鼠血浆中他泽美司他含量的方法,研究白花丹素与他泽美司他的中草药相互作用的药代动力学。大鼠血浆样品经乙腈沉淀后,以0.1%甲酸和乙腈为流动相进行梯 36 Tazemetostat in Rats by UPLC-MS/MS 度洗脱。采用ESI+源进行多反应监测,他泽美司他和ISTD的离子对分别为m/z573.12→135.99和m/z410.10→124.00。将12只SD大鼠随机分为对照组和实 验组,每组6只。实验组大鼠给予白花丹素100mg/kg 灌胃,每日1次,连续7天。对照组大鼠给予等量的0.1%羧甲基纤维素钠溶液,每日灌胃1次,连续7天。第7天给予他泽美司他(80mgkg),并在不同时间点采血。计算药代动力学主要参数,评价中草药相互作用。结果显示,在1~1000ng/mL的标定范围内,他泽美司他具有良好的线性关系。萃取回收率大于84%,批内精密度和批间精密度的RSD均小于15%。实验组比对照组高32.48%,AUC0-t和AUC0-∞实验组比对照组高46.24%和46.67%。
总而言之,团队建立了简单、快速、灵敏的UPLC-MS/MS测定动物血浆中多种药物的药代动力的方法,突破以往相关的药物检测技术的限制,进一步明确多种中药、西药等药代动力学变化,防止药物联用时不良反应或毒性作用的产生提供理论依据,使药物代谢分布参数更加明确,为临床安全用药提供依据。
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